Articles
13
Documents
Codon Optimization and Chaperone Assisted Solubilization of Recombinant Human Prethrombin-2 Expressed in Escherichia coli

Microbiology Indonesia Vol 8, No 4 (2014): December 2014
Publisher : Indonesian Society for microbiology

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar

Abstract

Prethrombin-2 (PT2) is a thrombin precursor, which plays a role in the conversion of fibrinogen into fibrin during blood clotting process. Previous study reported that the expression of human prothrombin-2 (rhPT2) in Escherichia coli formed inclusion bodies. The aim of this study was to establish a strategy to express a soluble rhPT2 in E. coli. This study was animed to design and codon optimize human prethrombin-2 gene as well as to optimize the expression condition using four strains of E. coli. The codon adaptation index (CAI) of the unoptimized hpt2 gene was 0.336, with 56.8% GC content. After optimization, the CAI of optimized hpt2 became 1.000 with 53.1% GC content. The optimized gene was successfully cloned into pTWIN1 expression vector. Expression analysis indicated that only E. coli ArcticExpress strain could successfully express a soluble recombinant rhPT2 protein, with only part of rhPT2 being expressed in insoluble form. However, the rest of the E. coli strains used in the experiments failed to express the rhPT2 in soluble form. We are deducing that the success in achieving soluble expression was not only due to the availability of chaperonins Cpn60/Cpn10, which played a crucial role in the protein folding in E. coli ArcticExpress strain, but also due to the codon optimization of hpt2 gene.

Penyimpanan Haloalkana Dehalogenase: Pengaruh Konsentrasi Terhadap Stabilitas dan Aktivitas Enzim

Chimica et Natura Acta Vol 5, No 3 (2017)
Publisher : Departemen Kimia

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (238.428 KB)

Abstract

Karena kebutuhan penyimpanan protein rekombinan dalam waktu yang sangat lama, berbagai macam kondisi penyimpanan telah disarankan dalam berbagai publikasi guna mempertahankan integritas struktur dan/atau aktivitas enzim asalnya. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh konsentrasi protein terhadap kestabilan penyimpanan dari haloalkana dehalogenase murni. Haloalkana dehalogenase rekombinan dimurnikan dengan dua langkah pemurnian, yaitu kromatografi penukar ion  dan afinitas. Dua kondisi konsentrasi enzim diobservasi selama 4 minggu. Aktivitas enzim diuji tiap minggu yang merefleksikan kestabilan dari enzim. Hasil menunjukkan bahwa konsentrasi enzim 0.5 mg/mL, dibandingkan dengan konsentrasi 2 mg/mL, lebih mudah mengalami inaktifasi dan kehilangan aktivitas. Peningkatan aktivitas dan stabilitas enzim bentuk konsentrat selama penyimpanan mungkin dipengaruhi oleh oligomerisasi protein. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi tinggi dari haloalkana dehalogenase direkomendasikan untuk proses penyimpanan enzim dalam waktu yang lama.

Pemurnian Pretrombin-2pH Hasil Ko-Ekspresi Chaperone pada Escherichia coli ER2566 Menggunakan Sistem IMPACT

Chimica et Natura Acta Vol 5, No 2 (2017)
Publisher : Departemen Kimia

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (420.794 KB)

Abstract

Pemurnian pretrombin-2 merupakan tahap penting dalam produksi trombin sebagai salah satu komponen lem fibrin untuk mengganti teknik jahitan pascabedah mata. Pemurnian pretrombin-2 melalui sistem IMPACT memanfaatkan aktivitas pemotongan intein yang membawa penanda afinitas chitin-binding domain dan tidak memerlukan enzim protease tambahan. Pemotongan pretrombin-2pH dari CBD-intein dapat dilakukan melalui C-terminal intein dengan induksi perubahan pH dan suhu tanpa memerlukan reagen kimia tambahan. Namun dibutuhkan kondisi pH, suhu dan waktu inkubasi yang sesuai untuk memotong pretrombin-2pH dari C-terminal intein. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan kondisi pH, suhu dan waktu inkubasi pemotongan yang dibutuhkan dalam pemurnian pretrombin-2pH dengan memanfaatkan aktivitas pemotongan C-terminal intein. Metode yang dilakukan adalah ekspresi gen CBD-intein-pt2pH menggunakan vektor pTWIN1 dalam E. coli ER2566 disertai dengan ko-ekspresi chaperone menggunakan plasmid pG-KJE8, isolasi CBD-intein-PT2pH dengan metode sonikasi, pemurnian pretrombin-2pH menggunakan sistem IMPACT, serta karakterisasi pretrombin-2pH hasil pemurnian dengan metode SDS-PAGE. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa kondisi inkubasi pemotongan yang dibutuhkan untuk mendapatkan pretrombin-2pH murni adalah pada suhu 25oC, selama 48 jam dengan perubahan pH lingkungan kolom dari 8,5 ke 7,0. Namun efisiensi pemotongan yang dihasilkan sangat kecil. Hal ini mungkin disebabkan oleh kondisi suhu dan waktu inkubasi yang belum optimum serta diduga masih terdapat reaksi proteolisis yang mendegradasi pretrombin-2pH murni yang dihasilkan.

Ekspresi Prethrombin-2 Manusia Recombinan dalamPichia pastoris dan Optimasi Kondisi Ekspresinya

Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology Vol 4, No 1 (2017)
Publisher : Indonesian Journal of Pharmaceutical Science and Technology

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (566.296 KB)

Abstract

Pretrombin merupakan prekursor dari trombin yang memiliki aktivitas proteolitik. Trombin merubah fibrinogen menjadi benang fibrin yang salah satu aplikasinya adalah dapat digunakan sebagai lem untuk menggantikan teknik jahitan pasca bedah. Aplikasi trombin untuk pembuatan lem fibrin menuntut diproduksinya trombin rekombinan. Tujuan dari penelitian ini adalah ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia rekombinan menggunakan sistem ekspresi Pichia pastoris. Gen pengode PT2 dirancang sesuaidengan kodon preferensi P. pastoris. Fragmen PT2 diamplifikasi dengan metoda PCR dengan penambahan sisi restriksi EcoR1 pada ujung 5’ dan sisi restriksi SacII pada ujung 3’. Produk PCR yang berukuran 924 pb diligasi dengan vektor ekspresi pPICZaB untuk P. pastoris dan disubkloning dalam inang Escherichia coli. Urutan nukleotida dikonfirmasi dengan metoda dideoxy Sanger. Plasmid rekombinan pPICZaB-PT2 kemudian digunakan untuk mentransformasi P. pastoris SMD1168 defisien protease dengan metoda elektroporasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen PT2 berhasil diamplifikasi dan dikloning dalam E. coli. Analisis restriksi dan penentuan urutan DNA menunjukkan bahwa PT2 rekombinan 100% homologi dengan hasil rancangan. Hasil ekspresi PT2 oleh P. pastoris menggunakan metanol sebagai inducer memperlihatkan bahwa PT2 dengan berat molekul 35 kDa berhasil diekspresikan. Optimasi kondisi ekspresi melalui variasi konsentrasi metanol sebagai inducer dan sorbitol sebagai sumber karbon tambahan menunjukkan bahwa metanol 2% dan sorbitol 2% merupakan kondisi optimum ekspresi PT2.

Cloning, Expression, and Functional Characterization of Autoactivated Human Prethrombin-2 Synthetic Gene by Using Pichia pastoris SMD1168 As a Host

Microbiology Indonesia Vol 10, No 2 (2016): June 2016
Publisher : Indonesian Society for microbiology

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (4368.912 KB)

Abstract

Prethrombin-2 is a thrombin precursor that has important role in blood coagulation. It is the smallest precursor which is activated into thrombin by FXa prior to coagulation process. However, as a commercial theurapetic protein in fibrin sealant component, prethrombin-2 must be activated by ecarin before used. Thus, the production process of this protein needs further purification. In order to eliminate ecarin activation step and to increase production efficiency, we designed, cloned and expressed the recombinant autoactivated human prethrombin-2 in Pichia pastoris SMD1168. The variant was designed with 4 mutations, E40A, D47A, G48P, and E52A, following the result of a previous study. The synthetic variant gene was first optimized to conform with P. pastoris codon preference. The optimized synthetic gene was cloned in pD912 plasmid using XhoI and SacII restriction enzymes. The transformed P. pastoris was selected on agar plate supplemented with 1,000 µg.mL-1 Zeocin as a selection marker. This study showed that autoactivated prethrombin-2 was succesfully expressed extracellularly by P. pastoris SMD1168. The activity of recombinant autoactivated prethrombin-2 using a chromogenic substrate S-2238 was 0.540 unit/mg. Taken together, these results demonstrated that autoactivated human prethrombin-2 was successfully produced extracellularly in P. pastoris.

Heterologous Expression of α-Amylase from Saccharomycopsis fibuligera R64 and its Tyr401Trp Mutant in Pichia pastoris

Microbiology Indonesia Vol 10, No 1 (2016): March 2016
Publisher : Indonesian Society for microbiology

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (1302.355 KB)

Abstract

α-Amylase from Saccharomycopsis fibuligera R64 is a non-adsorbing raw-starch degrading enzyme, a unique characteristic. This character is difficult to explain in the absence of its three-dimensional structure. Here we discuss the expression of a-amylase from Saccharomycopsis fibuligera in Pichia pastoris and the effect of site directed mutagenesis on its activity. A model based on the structure of its homologs suggested mutation of codon of Tyr401 into that of a Trp residue. An activity study using whole cells P. pastoris showed similar substrate degradation rates by cells carrying either the native or mutant amylase encoding gene. However, the purified enzyme of the mutant strain showed faster starch hydrolysis.

Kajian Ekspresi Gen Pretrombin-2 Manusia Sintetik pada Escherichia coli Secara In Silico Untuk Produksi Trombin Sebagai Komponen Lem Fibrin

Jurnal Pendidikan Kimia (JPKim) Vol 8, No 1 (2016): April 2016
Publisher : Jurnal Pendidikan Kimia (JPKim)

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar

Abstract

Abstrak. Pretrombin-2 merupakan prekursor trombin dan dapat berperan sebagai komponen lem fibrin (LF). LF merupakan biomaterial perekat yang dapat diaplikasikan sebagai pengganti teknik jahitan pasca operasi. Biomaterial ini terdiri dari trombin, fibrinogen dan faktor XIII sebagai komponen utamanya. Dalam LF, trombin rekombinan berperan sebagai enzim yang mengubah fibrinogen menjadi fibrin untuk membentuk benang-benang fibrin sehingga luka tertutup. Kajian ini bertujuan untuk memprediksi ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia sintetik pada Escherichia coli secara in silico. Urutan asam amino pretrombin-2 manusia yang diperoleh dari data GeneBank dirubah ke dalam bentuk wild type urutan nukleotida menggunakan software OPTIMIZER sesuai dengan kodon preferensi E. coli K12, Selanjutnya dianalisis dengan Graphical Codon Usage Analyzer dan dioptimasi secara menual berdasarkan preferensi kodon E. coli dari data Codon Usage Database. Untuk memprediksi tingkat ekspresinya pada inang E. coli, dipelajari kajian ekspresi PT2 secara in silico menggunakan perangkat lunak dalam jaringan OptimumGeneTM. Hasil analisis secara in silico urutan nukleotida PT2 hasil optimasi dan wild type terhadap kodon preferensi E. coli menunjukkan bahwa, persentase rata-rata kandungan GC hasil optimasi sebesar 54,71% sedangkan wild type 52,56%, PT2 hasil optimasi memiliki 100% kodon dengan frekuensi tinggi, sedangkan wild type hanya 67%, dan PT2 hasil optimasi memiliki nilai Codon Adaptasi Index  satu, sedangkan wild type hanya 0,89. Dengan demikian dapat diprediksi bahwa gen pretrombin-2 manusia sintetik kemungkinan akan diekspresikan tinggi di inang E. coli. Kata kunci: pretrombin-2, trombin, kodon preferensi, kajian ekspresi, E. coli

Purification of Recombinant Human Pretrombin-2 in Escherichia coli for Thrombin Production as Fibrin Glue Components

Jurnal Pendidikan Kimia (JPKim) Vol 9, No 1 (2017): April 2017
Publisher : Jurnal Pendidikan Kimia (JPKim)

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar

Abstract

Abstract: Pretrombin-2 (PT2) is a thrombin precursor that plays a role in converting fibrinogen to fibrin for the process of wound recovery. This material can be applied instead of eye surgery suture technique. The intein-mediated refining system to purify the protein is attractive to be developed, since the protein is obtained by one purification step, capable of self-splicing, the protein can be diffused in to the N-terminal (PT2 cutting of the intein induced marker changes in pH and temperature) and on the C-terminal (cutting PT2 from the intein-induced marker of the thiol reagent). In this study, we purified the PT2 fusion of the expression of E. coli BL21 (DE3) Arctic Express in the intein-mediated chitin matrix column. PT2 was fused with a tag at its N-terminal position, containing the sequence of intein codes SspDnaB followed by chitin binder domain (CBD). Furthermore, the PT 2 fusion was expressed on the E. coli host, then purified in the chitin matrix column. The PT2 cutting process of the intein marker induced changes in the pH and temperature in the column. PT2 fusion was successfully purified in the intein-mediated chitin matrix. The PT2 fusion cut from the induced intein buffer marker at pH 6.5 and incubation at the temperature of 25 oC for 48 hours.Keywords: E. coli, expression, intein mediated purification, pH and temperature changes, PT2

Pengaruh Suhu pada Ekspresi Pretrombin-2 Manusia Rekombinan di Escherichia coli ER2566

Jurnal Sains Indonesia Vol 42, No 1 (2018): Jurnal Sains Indonesia
Publisher : Universitas Negeri Medan

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar

Abstract

Human recombinant prethrombin-2 (rhPT-2) was expressed in Escherichia coli. Previous studies reported that the expression of rhPT-2 in E. coli tends to formed inclusion body. This study aims to determine the effect of temperature on the expression of rhPT-2 in E. coli ER2566. This study begins with the isolation of recombinant plasmids, competent cell preparation and transformation of competent cells of E. coli ER2566 strain, and rhPT-2 gene expression with various induction temperatures 12, 18, 22 and 30°C. Characterization results showed that the induction temperature of 22°C was the optimum temperature of rhPT-2 gene expression as a soluble fraction in E. coli ER2566 with IPTG concentration 0.1 mM. These results prove that the temperature affects the expression of rhPT-2 in E. coli ER2566.

Kajian Ekspresi Gen Pretrombin-2 Manusia Sintetik pada Escherichia coli Secara In Silico Untuk Produksi Trombin Sebagai Komponen Lem Fibrin

JURNAL PENDIDIKAN KIMIA (JPKim) Vol 8, No 1 (2016): April 2016
Publisher : JURNAL PENDIDIKAN KIMIA (JPKim)

Show Abstract | Original Source | Check in Google Scholar | Full PDF (879.476 KB)

Abstract

Abstrak. Pretrombin-2 merupakan prekursor trombin dan dapat berperan sebagai komponen lem fibrin (LF). LF merupakan biomaterial perekat yang dapat diaplikasikan sebagai pengganti teknik jahitan pasca operasi. Biomaterial ini terdiri dari trombin, fibrinogen dan faktor XIII sebagai komponen utamanya. Dalam LF, trombin rekombinan berperan sebagai enzim yang mengubah fibrinogen menjadi fibrin untuk membentuk benang-benang fibrin sehingga luka tertutup. Kajian ini bertujuan untuk memprediksi ekspresi gen pretrombin-2 (PT2) manusia sintetik pada Escherichia coli secara in silico. Urutan asam amino pretrombin-2 manusia yang diperoleh dari data GeneBank dirubah ke dalam bentuk wild type urutan nukleotida menggunakan software OPTIMIZER sesuai dengan kodon preferensi E. coli K12, Selanjutnya dianalisis dengan Graphical Codon Usage Analyzer dan dioptimasi secara menual berdasarkan preferensi kodon E. coli dari data Codon Usage Database. Untuk memprediksi tingkat ekspresinya pada inang E. coli, dipelajari kajian ekspresi PT2 secara in silico menggunakan perangkat lunak dalam jaringan OptimumGeneTM. Hasil analisis secara in silico urutan nukleotida PT2 hasil optimasi dan wild type terhadap kodon preferensi E. coli menunjukkan bahwa, persentase rata-rata kandungan GC hasil optimasi sebesar 54,71% sedangkan wild type 52,56%, PT2 hasil optimasi memiliki 100% kodon dengan frekuensi tinggi, sedangkan wild type hanya 67%, dan PT2 hasil optimasi memiliki nilai Codon Adaptasi Index  satu, sedangkan wild type hanya 0,89. Dengan demikian dapat diprediksi bahwa gen pretrombin-2 manusia sintetik kemungkinan akan diekspresikan tinggi di inang E. coli. Kata kunci: pretrombin-2, trombin, kodon preferensi, kajian ekspresi, E. coli